Arkiv-Bilaga 9 (Toxoplasma IF (CNS)

Från Referensmetodik för laboratoriediagnostik

Till innehållsförteckningen för Referensmetodik: Infektioner i centrala nervsystemet

---

Bilaga 9

Toxoplasma: Kvantitativ bestämning av antikroppar (IgG, IgM, IgA) med indirekt immunfluorescens

Indikation

Misstanke om toxoplasmos. Diagnosen aktuell toxoplasmos kan endast ställas på basen av flera olika analyser t ex IgG-agglutinationstest, IgG-aviditetstest, IgM-immunsorbent test/IgM-ISAGA, indirekt immunfluorescens (IgG, IgM, IgA).

Analysprincip

Indirekt immunfluorescens är en kvantitativ metod. Som antigen används toxoplasma-tachyzoiter acetonfixerade på objektglas. Patientprov inkuberas med tachyzoiterna. Efter inkubation tillsätts fluoresceinkonjugerade antihumanantikroppar. Avläsning sker i fluorescensmikroskop.

Provmaterial

Serum eller likvor som värmeinaktiverats 30 min, 56 °C. Provvolym: >=2 mL. Denna volym krävs då analysen ingår som en del av flera analyser för verifiering av toxoplasma, se ovan.

Provtagningsmaterial

Rör utan tillsats.

Apparatur

skakapparat

dragskåp

kylskåp

frysskåp

tidur

fluorescensmikroskop

pipetter: 5-40 μL, 40-200 μL, 200-1000 μL

Material

handskar

provrörsställ

spädningsrör av plast

glasbägare, 250 mL

kyvetter, varav en med lock

fuktkammare

filtrerpapper

allduk

objektsglas

täckglas 24 x 50 mm, nr 0

preparatbricka

spetsar till pipetter: 5-200 μL, 200- 1000 μL

Reagens

Antigen: Toxoplasma-tachyzoiter droppade på objektglas

Kontrollsera: Positiva och negativa kontrollsera

Konjugat: Fluoresceinkonjugerat antihuman-IgM, -IgA, -IgG

Konjugatkontroll: PBS ersätter serum

Aceton

Trypsineringsbuffert PBS pH 7,4

Evans blue 0,01 %

Monteringsbuffert med 0,002 % natriumazid

glycinbuffert pH 8,8 - (10 mL)

glycerol. 99,5 % pa - (90 mL)

Förvaras i 10 mL-portioner i glasflaska

Analysprocedur

• Skriv protokoll för IgG-, IgM- Och IgA-analyserna. Kontrollera om det finns tidigare serumprov från samma patient. Ej tidigare testade sera analyseras i spädning 1+9 och 1+29. Sera som redan testats späds med utgångspunkt från tidigare analysvärden. Likvorprov analyseras ospätt och i spädning 1+9.
• Tina proven och rumstemperera alla reagens.
• Märk spädningsrören enligt protokoll
• Skaka proven med skakapparat tills provet är homogent.
• Späd proven.
• Låt antigenglasen torka innan de fixeras.
• Fixera antigenglasen i aceton (dragskåp) 10 min i rumstemperatur Använd kyvett med lock.
• Märk antigenglasen enligt protokcll.
• Fukta filtrerpapperet i fuktkarninaren med PBS.
• Lägg antigenglasen i fuktkammaren.
• Tillsätt spädningar enligt protokoll. Se till att preparatet blir ordentligt täckt.
• Inkubera 30-45 min i rumstemperatur.
• Skölj ett antigenglas i sänder i en bägare fylld med PBS. Låt överskott v vätskan rinna av mot allduk.
• Placera därefter glasen i första kyvetten fylld med PBS - låt stå 5-10 min.
• För över antigenglasen till den andra kyvetten fylld med PBS. Låt överskott av vätskan rinna av mot allduk. Låt stå 5-10 min.
• Späd konjugat i 0,01 % Evans Blue.
• Torka av antigenglasen med filtrerpapper runt brunnarna och lägg dem åter i fuktkammaren. OBS! Preparaten får ej torka.
• Tilllsätt konjugat. Se till att preparatet blir ordentligt täckt.
• Inkubera 30-45 min i rumstemperatur.
• Skölj enligt punkt 13 - 15.
• Torka av antigenglasen med filtrerpapper på baksidan och runt brunnarna. OBS! Preparaten får ej torka.
• Tillsätt 1-2 droppar monteringsbuffert på antigenglasen.
• Lägg på täckglas och placera antigenglasen på preparatbricka.
• Avläs färgintensiteten i fluorescensmikroskop, försett med 25x objektiv och l0x okular.

Gradera fluorescensintensiteten: - (negativ), 1+ (ett plus)¹, 2+ (två plus)², 3+ (tre plus)³.

Om avläsning ej sker direkt förvaras glasen i kylskåp och avläses inom en vecka.

• 1) Svag reaktion med tachyzoitytan
• 2) klar reaktion med tachyzoitytan
• 3) intensiv reaktion med tachyzoitytan

Metodfel: ± 1 titersteg.

Ej acceptabla analysresultat:

Kontrollerna reagerar ej som förväntats.

för få eller inga parasiter på objektglaset.

Analysresultat som avviker mer än ±1 titersteg jämfört med tidigare restiltat av samma prov.

Kalibrering av test

Anti-toxoplasma serum, human, tredje internationella standard 1994, Seruminstitut, WHO International Laboratory for Biological Standards, Copenhagen, Denmark.