Bilaga 6 Mykobakterier; substrat-och reagensrecept

Från Referensmetodik för laboratoriediagnostik

Sekundärartikel till Tuberkulos-laboratoriediagnostik

---

Innehåll 1 Mykobakterier; substrat- och reagensrecept 1.1 Löwenstein-Jensen medium 1.2 Reagens för dekontaminering av prov 1.3 Reagens för fluorescensmikroskopi 1.4 Reagens för Hallbergfärgning

Mykobakterier; substrat- och reagensrecept

Löwenstein-Jensen medium

(OBS! 3 tillverkningsdagar)

• Dag 1
  • 1. Lutlösning, saltlösning och malakitgröntlösning prepareras (se nedan).
• Dag 2
  • 1. Ägg (32 st per hel sats) placeras i hinkar.
  • 2. Lutlösningen hälls över äggen (glasögon och handskar).
  • 3. Efter 3 timmar hälls lutlösningen av, varefter äggen sköljs med rinnande vatten i 4 timmar.
  • 4. Vattnet hälls av och äggen får stå i kyl 4 ºC över natten.
• Dag 3
  • 1. Äggen tas upp med sterila handskar och slås upp, ett i taget, i en steril bägare. Kontrollera att inget är skämt. Äggen vispas ihop med en steril visp. 1340 mL ägglösning hälls ned i en steril 5 L E-kolv och skakas i skakmaskin 10 minuter.
  • 2. En sats saltlösning och 26 mL malakitgröntlösning tillsätts.
  • 3. Skakas i skakmaskin 10 minuter. Blandningen filtreras genom gasväv (steril) och får vila i 20-30 minuter.
  • 4. Dispenseras i sterila odlingsrör.
  • 5. Mediet koaguleras i värmeskåp 80-85 ºC 1 timme.

• Lutlösning:
  • Till 2 hinkar med 8-10 L vatten tillsätt
    • ≈ 100 mL lutpastiller NaOH, som får lösa sig till följande dag.

OBS! Glasögon och handskar måste användas vid hanteringen av lutlösningen.

• Saltlösning
  • Kalium-di-vätefosfat KH₂PO₄ ---- 3,2 g
  • Magnesiumfosfat MgSO₄x7H₂O ---- 0,32 g
  • Tri-Magnesium-dicitrat C₁₂H₁₀Mg₃O₁₄x14 H₂O ---- 0,8 g
  • L-Aspargin ---- 4,8 g
  • Glycerol ---- 16,0 mL
  • 1 M HCl ---- 50,0 mL
  • Avjoniserat vatten ---- 700,0 mL

• 1. Saltlösningen vägs upp i 1500 mL E-kolv.
• 2. Värms till nästan kokpunkt.
• 3. 40 g potatisstärkelse löses i 100 mL avjoniserat vatten.
• 4. Stärkelselösningen tillsätts under omskakning.
• 5. Autoklaveras i 20 minuter, 120 ºC.
• 6. Efter autoklavering förvaras kolvarna i rumstemperatur.

• Malakitgrönt 2 % lösning
  • Malakitgrönt-oxalat ---- 3,0 g
  • Avjoniserat vatten ---- 150 mL

• 1. Malakitgrönt-oxalat vägs upp i 300 mL glasflaska.
• 2. Avjoniserat vatten tillsätts.
• 3. Flaskan placeras i vattenbad med kokande vatten.
• 4. Flaskan skakas då och då tills pulvret gått i lösning.

Reagens för dekontaminering av prov

• NALC och NaOH
  • A. 4% NaOH ----- 500 mL
  • B. 2.9 % natriumcitrat dihydrat eller 2.6 % vattenfri natriumcitrat ----- 500 mL
  • C. NALC (tillverka dagligen) ----- 5 g
  • D. pH 6,8 fosfatbuffert (eller sterilt destillerat vatten)

Blanda A och B, sterilisera och förvara för användning senare. Tillsätt reagens C strax innan användning. Förbrukas inom 24 timmar.

• Natriumlaurylsulfatlösning
  • Natrium laurylsulfat 99,9 % ---- 45 g
  • Avjoniserat vatten ---- 1500 mL
  • Natriumhydroxid, NaOH ---- 15 g

Laurylsulfatet löses i ca 60 ºC vatten, NaOH tillsätts innan utfällningen börjar. Använd mycket rena kärl. Fylls med ca 750 mL på 1 liters flaskor och autoklaveras i 120 ºC i 20 min. Ställs i 37 ºC termostat snarast.

• Neutralisationslösning för dekontaminering
  • Svavelsyra H₂SO₄ konc. (98 %)---- 0,9 mL
  • Avjoniserat vatten ---- 1000 mL
  • Bromkresolpurpur 1 % ---- 0,8 mL

Blandas, fylles med ca 1000 mL på 1 liters flaskor. Autoklaveras 120 ºC i 20 minuter.

Reagens för fluorescensmikroskopi

• Auramin
  • Auramin ---- 3,0 g
  • Fenol ---- 32 mL
  • H₂O ---- 968 mL

• Syra-alkohol lösning.
  • 3,0 mL koncentrerad HCl adderas långsamt till 97,0 mL 90-95 % etanol (stark värme kan utvecklas).

Reagens för Hallbergfärgning

• Stamlösningar
  • Nachtblaulösning
  • Nachtblau ---- 5 g
    • 95 % alkohol ---- 100 mL
  • K₂SO₄-lösning K₂SO₄ ---- 4 g
    • Aq dest ---- 100 g
• Brukslösningar
  • Nachtblaulösning, bruks
  • Aq dest ---- 405 mL
  • K₂SO₄ -lösning ---- 4,5 mL
  • Nachtblaulösning ---- 45 mL

Nachtblaulösning måste efter hopblandningen upphettas till 75 º-80 ºC innan den används.

• Fuchsinlösning
  • Fuchsin ---- 1 g
  • (för kontrastfärgning) 70 % alkohol ---- 1000 mL

• PANTA

• • Polymyxin B ---- 50 enheter/mL
  • Amfotericin ---- 5 mg/L
  • Nalixidinsyra ---- 20 mg/L
  • Trimetoprim ---- 5 mg/L
  • Azlocillin ---- 10 mg/L

Färdig lösning kan köpas från Becton Dickinson.