Bilaga 3 Nukleinsyrapåvisning-NLI

Från Referensmetodik för laboratoriediagnostik

Till innehållsförteckningen för Nedre luftvägsinfektioner inklusive mykobakteriologisk diagnostik, 2:a upplagan 2005

---

Innehåll 1 Nukleinsyrapåvisning-NLI 1.1 Nukleinsyrapåvisning av Mycoplasma pneumoniae 1.2 Nukleinsyrapåvisning av Chlamydophila pneumoniae 1.2.1 REFERENSER 1.3 Nukleinsyrapåvisning av Bordetella pertussis (ej referensmetodik) 1.3.1 REFERENSER

Nukleinsyrapåvisning-NLI

Nukleinsyrapåvisning av Mycoplasma pneumoniae

PCR Analysprincip: Analys sker med PCR–metod genom amplifiering av konserverade nukleinsyra-(DNA)-sekvenser (mål–DNA) inom gen för Mycoplasma pneumoniae P–1 adhesin protein. Vid analysen upphettas provet så att DNA denatureras. Primers specifika för i provet eventuellt befintligt mål–DNA binder till detta. Med hjälp av termostabilt polymeras kopieras därefter mål–DNA - sekvenserna under 40 cykler vilket resulterar i ca 10⁹ kopior av amplimer med 466 baspar. Detektion av slutprodukten sker med elektrofores.

Reagens

• Primer 1 och 2 (p-11 och p12):
• p-11: 5´-TGC CAT CAA CCC GCG CTT AAC –3´
• p-12: 5´-CCT TTG CAA CTG CTC ATA GTA –3
• AmpliTaq Polymeras (Applied Biosystems), Biotech 10xPCR – buffert med BSA och30 mM MgCl2. 10x Sucrose/cresol (Biotech), 10x dNTP mix (CHASE, Applied Biosystems).

• Amplicor Respiratory Specimen Preparation Kit (”Lysis reagent”, Roche Diagnostics).

Kontroller: Negativ kontroll och kontaminationskontroll: sd H₂O.

• Positiv kontroll: Renat DNA från M. pneumoniae (Quiagen).

Analysprocedur

• DNA-extraktion
  • Vortexa rör med kvarvarande pinne minst 1 minut. Pipettera 1 mL till sterilt eppendorfrör. Centrifugera 15 min och pipettera av överfasen.

• • Tillsätt 50 μL ”lysis reagent” och skaka upp pelleten. Inkubera rören 45 minuter vid 60 °C på värmeblock eller vattenbad.
  • Tillsätt 50 μL ”neutralisation reagent” och 100 μL sdH₂O.
  • Ta av 5 μL och späd i 45 μL sdH₂O (templat).

• Mix/PCR-rör
  • sdH₂O 3,9 μL
  • 10x buffert med BSA, 30 mM MgCl2 1,0 μL
  • 10xdNTP mix (CHASE) 1,0 μL
  • primer 1 (10 pmol/μL) 0,5 μL
  • primer 2 (10 pmol/μL) 0,5 μL
  • Taq-Polymeras 0,1 μL

Tillsätt 2 μL templat – DNA (patientprov resp. kontroller) till resp. PCR-rör.

• PCR-program
  • 15 sek 94 °C
  • 5 sek 94 °C
  • 5 sek 50 °C 40 cykler
  • 35 sek 72 °C
  • 30 sek 72 °C

Trippelprov körs på alla patientprover.

Negativ kontroll och kontaminationskontroll: 2 μL dd H₂O till 8 μL PCR – mix.

Positiv kontroll: 2 μL renat DNA från M. pneumoniae till 8 μL PCR-mix.

Identifiering Gelelektrofores Utförs enligt lokal metod. Band med förväntad storlek motsvarande 466 baspar avläses som positivt PCR – resultat.

Kvalitetskontroll: För att körning skall godkännas skall analyskontrollerna ge förväntat resultat och ge rätt bandstorlek.

Extern kontroll saknas för närvarande.

Stammarna förvaras i –70 °C.

Nukleinsyrapåvisning av Chlamydophila pneumoniae

PCR-undersökning avseende Chlamydophila pneumoniae och C. psittaci modifierad från Tong och Sillis (1993). Metoden har prövats under lång tid och vid flera laboratorier och har rekommenderats som referensmetod tillsammans med ytterligare ett par metoder ( Dowell et al. 2001).

Metoden bygger på en PCR i två steg med efterföljande gelelektrofores.

Prov extraheras med Magna Pure eller liknande.

10 µL prov sätts till 40 µL PCR-mix bestående av 200 µM av varje nukleotid samt 0,5 µM av varje primer. Taq-polymeras 1,5 enheter /prov (Promega, Madison, WI, USA) i buffert A tillsammans med Mg-klorid 2,0 mM ingår också i mixen.

Efter första PCR-omgången späds provet 1/50 i vatten varefter en ny PCR-omgång med inre primers utföres enl. ovan.

• PCR-steg
  • 95 ºC i 3 min
  • därefter
  • 95 ºC i 1,5 min, 56 ºC i 1,5 min och 72 ºC
  • 40 cykler

• Primers
  • Externa (sense): 5´-TTA CAA GCC TTG CCT GTA GG – 3´
  • (anti-sense): 5`-GCG ATC CCA AAT GTT TAA GGC – 3`
  • Interna (sense): 5`- TTA TTA ATT GAT GGT ACA ATA – 3`
  • (anti-sense): 5´- ATC TAC GGC AGT AGT ATA GTT – 3´

Gelelektrofores utförs i 2 %-ig agarosgel i TBE-buffert med etidiumbromid enl. standardrecept.

REFERENSER

• Tong CY, Sillis M. 1993. Detection of Chlamydia pneumoniae and Chlamydia psittaci in sputum samples by PCR. J Clin Pathol. 46:313-7.

• Dowell SF, Peeling RW, Boman J, Carlone GM, Fields BS, Guarner J, Hammerschlag MR, Jackson LA, Kuo CC, Maass M, Messmer TO, Talkington DF, Tondella ML, Zaki SR. 2001. Standardizing Chlamydia pneumoniae assays: recommendations from the Centers for Disease Control and Prevention (USA) and the Laboratory Centre for Disease Control (Canada). Clin Infect Dis. 33:492-503.

Nukleinsyrapåvisning av Bordetella pertussis (ej referensmetodik)

Analysprincip: DNA-sekvenser förstärks genom PCR av realtidstyp med probe detektion av R-Q-typ, även kallad TAQMan®probe. Metoden är modifierad efter Kosters K, 2001. Målgenen utgörs av IS481, ett repeterat DNA-element som förekommer i B. pertussis men där även andra Bordetella spp kan bära samma eller liknande sekvenselement. Metoden har rekommenderats av en europeisk grupp för studier av B. pertussis toxin, recA eller annan alternativ målgen.

Vid positiv B. pertussis-PCR bör även primärt provmaterial utodlas och erhållen stam sändas till SMI, alternativt sänds primärt provmaterial direkt till SMI för odling. SMI som utför epidemiologisk typning ersätter insändande laboratorium för insänt isolat.

Reagens

• DNA-extraktion
  • Roche respiratory kit (Amplicor)

• Oligonukleotider:
  • Forward (PPert): ATC AAG CAC CGC TTT ACC C
  • Reverse (APPert): TTG GGA GTT CTG GTA GGT GTG
  • Probe(SPert) FAM-AAT GGC AAG GCC GAA CGC TTC A.Dabcyl

Utförande

• Provberedning
  • Pinnprov och nasofarynxutsug, i andra hand andra typer av sekret från luftvägarna. Provtagningspinne placeras i ett sterilt rör med ca 1 mL vatten och vortexas därefter. Suspenderat prov överförs till lagringsrör. Provtagningssetet sparas i kyl till efter PCR-analysen.

• DNA-extraktion
  • 1. 200 μL wash buffert tillsätts 200 μL prov.
  • 2. Blandas på vortex och centrifugeras 10 min 12500 rpm.
  • 3. Överfasen avlägsnas och 100 μL lysis buffert tillsätts.
  • 4. Proverna vortexas snabbt och spinns ner innan de inkuberas 45 min i 60 °C.
  • 5. Proverna spinns ner snabbt och 100μL neutralisationsbuffert tillsätts. Proverna vortexas snabbt och spinns ner.
  • 6. Proverna fördelas på två rör och fryses i –70 °C. Om analysen utförs samma dag, vilket förordas, förvaras en alikvot i kyl för denna analys.

• Realtids-PCR
  • 12,5 μL Hotstar-mix (QIAgen)
  • 600 nM Forward-primer (PPert)
  • 900 nM Reverse-primer (APPert)
  • 300 nM MgCl₂ (1,5 mM MgCl₂ motsvarar 1xHotstar Taq-mix)

Total volym per reaktion: 25 μL (20 μL mix och 5 μL templat).

• Program (Instrument Rotorgene 3000)
  • 15 min 95 °C
  • [15 s 95 °C, 1 min 57 °C]x45 (avläsning av fluorescensen efter 1 min 57 °C).

REFERENSER

• Kosters K, Riffelmann M, Wirsing von König C H. 2001. Evaluation of a real-time PCR assay for detection of Bordatella pertussis and B. parapertussis in clinical samples. J Med Microbiol 50: 436-440.